編者按：

        光老化被認(rèn)為是紫外線輻射損傷在皮膚老化基礎(chǔ)上的疊加，作為一種退變過程而引起人們的廣泛關(guān)注，尤其是A型長(zhǎng)波紫外線(UVA)，UVA過度輻照將導(dǎo)致皮膚紅斑生成、ROS異常表達(dá)、MMPs、COX-2等生成并導(dǎo)致炎癥發(fā)生，推動(dòng)光老化。自噬與衰老密切相關(guān)，具有許多共同的特征，在衰老機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬能夠延緩器官功能退化，這表明兩者在細(xì)胞中可能發(fā)揮相似的功能和作用。隨著研究的進(jìn)展，許多證據(jù)提示：自噬，同樣可能與有機(jī)生物體內(nèi)最大的器官-皮膚組織的老化密切相關(guān)。研究證實(shí)，自噬可以通過清除UV輻照細(xì)胞內(nèi)受損的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，修復(fù)DNA，幫助細(xì)胞恢復(fù)代謝穩(wěn)態(tài)，為光老化受損的皮膚提供保護(hù)作用。適度的自噬有助于抑制紫外線損傷皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞，維持正常的細(xì)胞自噬水平有助于抵抗UVA所致的光老化。維生素K3(Vit K3)是一種合成的類似Vit K的物質(zhì)，作為維生素原在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性形式。最近一些研究表明，Vit K3具有誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的功能。

        徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科魏志平醫(yī)生與徐州醫(yī)科大學(xué)研究生院韓伊楊醫(yī)生團(tuán)隊(duì)， 以人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞）作為體外UVA輻照光老化細(xì)胞的模型，旨在初步探索Vit K3對(duì)UVA輻照下角質(zhì)形成細(xì)胞的生物學(xué)作用，以期進(jìn)一步為光老化治療的研究提供理論依據(jù)和新的思路。

1 方  法

試劑與儀器：

        維生素K3（美國(guó)Sigma公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁有限公司）；倒置熒光顯微鏡（美國(guó)賽默飛公司），兔抗人β-actin單克隆抗體（Abcam公司）；兔抗人COX2單克隆抗體（Abcam公司）；兔抗人MMP1單克隆抗體（Abcam公司）；兔抗人LC3B單克隆抗體（Abcam公司）；手提UVA紫外燈（徐州科諾公司）。Vit K3以二甲基亞砜（DMSO）配制成濃度為100mM的母液（DMSO濃度≤2‰）保存，使用時(shí)用DMEM培養(yǎng)基稀釋至工作濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組：

        HaCaT細(xì)胞株（上海復(fù)祥生物科技有限公司）。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)。以8×103 個(gè)/孔將細(xì)胞接種至96孔板，每組6個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱過夜。運(yùn)用CCK8法測(cè)出Vit K3對(duì)細(xì)胞的最大無(wú)毒濃度，在此濃度之下預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終分為5組，即陰性組（只含培養(yǎng)液并進(jìn)行假照光）、單純光照組、0.125μM、0.25μM和0.5μM Vit K3藥物干預(yù)組。藥物干預(yù)組于照光前Vit K3預(yù)處理24h，照光后繼續(xù)孵育24h，陰性組及單純光照組則加入無(wú)血清培養(yǎng)基孵育相同時(shí)間。

 構(gòu)建UVA光老化HaCaT細(xì)胞模型：

        96孔板細(xì)胞貼壁后吸棄原培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，每孔加入35μl冷PBS覆蓋細(xì)胞，用遮光板遮住不需要照射的細(xì)胞組，進(jìn)行UVA照光。紫外輻照儀測(cè)得本實(shí)驗(yàn)持有的UVA紫外燈燈管的光照強(qiáng)度平均約為5.02mW/cm2 。根據(jù)公式：光照劑量（mJ/cm2 ）=光照強(qiáng)度（mW/cm2 ）×光照時(shí)間（s）計(jì)算。為了達(dá)到分組所需的輻照劑量（5J/cm2 、10J/cm2 、15J/cm2 ），細(xì)胞需要分別暴露于UVA輻照下16.6min、33.2min、49.8min。

        CCK-8法檢測(cè)Vit K3對(duì)HaCaT細(xì)胞活性的影響：終止培養(yǎng)后，每孔避光加入CCK-8試劑10μl（原96孔板每孔加入試劑量為90μl），置于培養(yǎng)箱中孵育2h，然后將96孔板移至酶標(biāo)儀中，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的吸光度（A值），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞存活率（%）=（給藥組A值-空白孔A值）/（陰性組A值-空白孔A值）×100%。

        DCFH-DA熒光探針檢測(cè)HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS的水平：

        培養(yǎng)結(jié)束后，DCFH-DA母液用無(wú)酚紅培養(yǎng)基稀釋避光孵育細(xì)胞30min，流式組消化收集細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)，在488nm激發(fā)波長(zhǎng)和530nm發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度，每個(gè)樣品收集10 000個(gè)HaCaT細(xì)胞，保存并分析數(shù)據(jù)。拍照組，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍攝圖片。

         Western blot法檢測(cè)Vit K3對(duì)HaCaT細(xì)胞中蛋白表達(dá)情況：

        收集細(xì)胞，提取蛋白，將各組蛋白原液稀釋到同一濃度，然后用上樣緩沖液配平蛋白樣本，95℃孵育10min，制備好的蛋白樣品使用聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，一抗孵育，然后TBST洗膜，洗3次，每次5min，二抗孵育后，滴上ECL發(fā)光液，使用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行顯色。

2 結(jié)  果

        與單純光照組相比，維生素K3能夠促進(jìn)光老化HaCaT細(xì)胞的體外增殖，且呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；藥物干預(yù)組HaCaT細(xì)胞的ROS含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；細(xì)胞 內(nèi)MMP1、COX2蛋白表達(dá)降低，LC3B表達(dá)增，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 結(jié)  論

        維生素K3能夠?qū)VA輻照HaCaT細(xì)胞提供光保護(hù)作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞自噬有關(guān)。